第二期：结构脂质组学的分析工作流程｜AC综述特刊
近日，清华大学化学系瑕瑜教授、精密仪器系张文鹏副教授及同系博士后刘易昆(现清谱科技创新设计中心脂质组学科学家)，于分析化学领域国际权威期刊Analytical Chemistry发表了题为“Structural Lipidomics Enabled by Isomer-Resolved Tandem Mass Spectrometry”的综述文章，系统阐述了结构脂质组学这一前沿交叉领域的发展与趋势。
该文系统梳理了串联质谱(MS/MS)技术用于脂质精细结构表征的原理与方法学进展，阐述了脂质结构解析技术与多元分析平台相集成的工作流程，回顾了近年来该方向在基础代谢研究与生物医学应用中的关键成果，并对当前面临的方法学挑战与未来发展趋势进行了展望。
上期重点探讨了脂质组学的兴起及基于串联质谱的脂质精细结构解析策略。本期将围绕结构脂质组学的分析工作流程展开，系统介绍其核心环节，包括鸟枪法脂质组学、液相色谱-串联质谱联用(LC-MS/MS)、空间脂质组学成像与数据分析工具，旨在为相关实验设计与数据处理提供一套标准化的实用方案参考。
结构脂质组学的分析工作流程
为实现生物脂质组中脂质分子的全面鉴定，多种异构体分辨串联质谱方法已被整合至不同的脂质组学工作流程中。
鸟枪法脂质组学工作流程
鸟枪法脂质分析采用将脂质提取物直接进样至质谱仪的方式，无需预先色谱分离。该方法能够快速、全面地分析脂质种类，实现对多种脂质类别及分子种属的鉴定与定量。
Ma等人将Paternò–Büchi(PB)反应串联质谱联用与鸟枪法分析相结合，用于分析复杂混合物中的脂质C=C位置异构体。PB反应快速的动力学特性使其适合与离子化过程在线联用。在该方法中，含脂质样品与PB试剂的溶液被注入到纳升电喷雾Tip中，并用254 nm紫外光照射。此方法已成功应用于来自细胞、组织和血液样本中多类脂质C=C位置异构体的定性与相对定量分析。
图 1. 脂质C=C位置异构体的表征与定量分析流程
(图源：Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2016, 113 (10), 2573–2578)
Stinson等人展示了另一种方案，使用熔融石英毛细管作为紫外微流反应器，并与直接进样电喷雾电离串联质谱联用。Tang等人则将按需电化学环氧化反应与串联质谱技术联用，以鉴定C=C位置异构体。其他能够解析异构体的串联质谱方法，如臭氧诱导解离(OzID)、紫外光解离(UVPD)和环氧化-串联质谱等，也已整合到鸟枪法脂质组学工作流程中。
然而，鸟枪法缺乏脂质分离步骤，可能导致离子化抑制以及异构体、同重素干扰，从而限制定性与定量分析的灵敏度和准确性。为解决此问题，色谱分离、离子淌度分离等技术被引入鸟枪法脂质组学工作流程，有效提升了对脂质异构体表征的覆盖度。
色谱-质谱联用工作流程
多种C=C定位分析方法已成功与LC-MS在线或离线耦合，以增强脂质C=C双键异构体的鉴定灵敏度、覆盖度、准确度。
为实现PB-MS/MS与LC-MS的在线联用，Zhang等人开发了一种由紫外透明的氟化乙烯丙烯管制成的流动微反应器，确保反应体系在整个流路中能均匀接受紫外光照射。丙酮在此被用作亲水相互作用色谱(HILIC)分离的流动相、PB反应试剂以及电喷雾离子化的挥发性溶剂。利用该工作流程，研究人员在C=C位置水平上对牛肝提取物中超过200种不饱和甘油磷脂进行了分析。
图 2. 基于LC-PB-MS/MS技术鉴定脂质C=C位置的工作流程
(图源：Nat. Commun. 2019, 10 (1), 79)
为提升对醚脂与双酰基磷脂同重素、链组成异构体以及C=C顺/反异构体的分离能力，在线丙酮PB反应被整合到反相液相色谱-质谱(RPLC-MS)工作流程中。另外，Xia等人将离线PB反应、HILIC分离、捕获离子淌度谱(TIMS)以及异构体解析MS/MS技术整合到一个工作流程中，用于在C=C位置和sn-位置水平上分析甘油磷脂。这种HILIC-TIMS-MS联用配置利用了两种快速的正交分离维度，极大地增强了对同重素和低丰度脂质的分析能力。
图 3. 磷脂深度分析工作流程
(图源：Nat. Commun. 2023, 14 (1), 4263)
异构体分辨质谱成像工作流程
能够解析异构体的MS/MS方法也被整合到质谱成像技术中，用于绘制组织样品上脂质异构体的空间分布图。
例如，Wäldchen等人使用苯甲酮和2-苯甲酰吡啶等试剂作为基质辅助激光解吸电离(MALDI)技术中的反应性基质，在343 nm激光照射下，同时促进不饱和甘油磷脂的解吸/离子化及其衍生化反应。其他多个研究组也展示了离线PB衍生化与MALDI-MS/MS联用进行成像的工作。另一份报告中，OzID技术与MALDI-MS联用，实现了对脂质C=C位置和sn-位置异构体的成像。Klein等人则将193 nm UVPD与解吸电喷雾电离(DESI)-MS技术结合，对组织样品中的脂质C=C位置异构体进行成像。由于组织切片上的样品量有限，很难在每个采样点进行多次MS/MS分析，这阻碍了依赖MS/MS进行结构鉴定的多种脂质异构体的成像。
近日，Guo等人开发了一种基于双线性离子阱质谱仪的MALDI-MS/MS成像方法，可在每个采样点进行多次MS/MS实验。在该方法中，经MALDI离子化产生的离子脉冲被捕获在第一个线性离子阱中，然后根据质荷比将目标离子依次传输到第二个线性离子阱进行分析。结合组织上的PB衍生化技术，这种MALDI-MS成像方法使得能够在组织样本的每个像素点上获取超过10种前体离子的信息。通过将组织上的PB衍生化、纳升解吸电喷雾电离成像以及线性离子阱上的并行碰撞诱导解离(CID)技术相结合，研究人员成功在大鼠脑组织和肝癌组织样本上实现了对C=C位置异构体和sn-位置异构体的同步成像。
图 4. nano-DESI-PB-MS³质谱成像技术
(图源：Anal. Chem. 2024, 96 (10), 4259–4265)
结构脂质组学数据分析方法
目前，已有许多数据分析工具能够在总组成水平或链组成水平上对脂质进行注释；然而，其中极少具备解析异构体分辨MS/MS数据的能力。为在精细结构水平上注释脂质，目前已发展出两种策略：基于谱库的注释和从头注释。
基于谱库的检索方法需要使用已知脂质标准品构建定制数据库，这些数据库通常包含保留时间、精确质量、脂肪酰基与烷基组成信息以及C=C断裂模式。LipidOZ与MZmine 2便是为基于谱库的脂质异构体分析而开发的工具。LipidOZ专为通过LC-OzID-IMS-MS工作流程，注释脂肪酸、甘油磷脂、甘油脂和鞘脂的C=C位置而设计。MZmine 2则主要用于从PB-MS/MS数据中，注释有限类别脂质的C=C位置。
Zhang等人开发了名为LipidOA的工具，用于对LC-PB-MS/MS数据进行脂质C=C位置的从头分析。该方法的核心是将质谱图映射为有向无环图，以识别可能产生所检测到的C=C诊断离子的脂肪酰基链。此方法能够生成与观测到的诊断离子相对应的所有可能的不饱和脂肪酰基链，从而辅助脂质结构鉴定。
最近，电子碰撞诱导电离解离(EIEIO)技术的数据已被整合到MS-DIAL软件中，使其能够表征甘油磷脂的sn-位置和C=C位置。
清谱科技开发的Ω Explorer则集成了智能算法引擎，实现了从质谱数据采集到双键位置解析的全流程自动化，为精准脂质组学研究提供系统化的解决方案。
总结与展望
异构体分辨串联质谱技术的发展，推动形成了基于鸟枪法、液相色谱-质谱联用及质谱成像的结构脂质组学主流分析路径。然而，现有方法仍面临定量可靠性、分析通量、检测灵敏度及多维数据整合的局限。未来需推动分析流程标准化，提升灵敏度与通量，并发展能自动化解析多维质谱数据的智能平台，从而为阐明脂质异构体功能及发现相关生物标志物提供更可靠的分析体系。在第三期内容中，我们将重点介绍结构脂质组学在脂质代谢研究和生物医学应用中的具体案例与前沿进展，敬请期待~
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